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Monitorização da Qualidade Microbiológica das Areias
Pesquisa de agentes patogénicos em amostras de água e areia de praias litorais e interiores da Costa Portuguesa
Preparação do Projecto Após aprovação do conteúdo do projecto por todas as entidades participantes elaborar-se-á um protocolo a celebrar com as diferentes instituições, onde serão definidas as respectivas competências, obrigações e participações descritas em seguida: Associação Bandeira Azul da Europa (ABAE)
Introdução A qualidade ambiental das praias tem vindo a adquirir uma importância crescente entre os critérios de escolha de destino turístico. Apesar de nos últimos anos a legislação ter evoluído no sentido do ordenamento da zona costeira e do tratamento de águas residuais, o único indicador da qualidade relacionado com a saúde publica que pode permitir aos utentes uma escolha orientada, é a qualidade da água balnear. Justifica-se o estudo da qualidade microbiológica da areia, tendo em consideração que a actual directiva 2006/7/EC defende toda uma estrutura de protecção de qualidade da água balnear e zona envolvente bem como a saúde dos seus utilizadores. Também a Organização Mundial de Saúde no guia “Guidelines for safe recreational waters Volume 1 - Coastal and fresh waters” (publicado em 2003) exprime a preocupação com a qualidade das areias da praia por estas poderem constituir um reservatório de agentes de infecção, sobretudo em zonas balneares onde a utilização da areia apresenta maior relevância. Perante esta motivação, a Associação Bandeira Azul da Europa, o Instituto do Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge e a Agência Portuguesa do Ambiente reuniram esforços no sentido de validar a metodologia desenvolvida em estudos anteriores e alargar a sua aplicação ao território insular. Tendo consciência de que a pesquisa de indicadores nem sempre fornece informação sobre agentes patogénicos específicos e/ou de importação, e na sequência de colaborações anteriores com grande sucesso, decidiram a ABAE, o INSA e a APA desenvolver esforços no sentido de aprofundar o conhecimento sobre a presença e detecção de agentes do tipo referido em zonas balneares do território nacional. Historial Em 2001, no âmbito da campanha «Areia Limpa, Praia Saudável» promovida pela Associação Bandeira Azul da Europa, realizou-se um estudo que envolveu directamente o Instituto do Ambiente (IA) e o Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA), entre outros parceiros, que teve como objectivo seleccionar os indicadores de qualidade que melhor caracterizam a contaminação microbiológica das areias das praias, propor os respectivos valores de referência e os métodos de análise mais adequados para a determinação dos indicadores seleccionados. Posteriormente ambas as entidades, no âmbito de um projecto europeu – “Improving Costal and Recreational Watwers” (ICREW) – procederam à revisão, validação e desenvolvimento de alguns conceitos. As conclusões de ambos os estudos foram as seguintes:
Parâmetros Micológicos: Parâmetros Bacteriológicos: Tabela 1: Parâmetros microbiológicos pesquisados.
Tabela 2: Valores máximos recomendados, novos valores máximos recomendados (resultado de revisão dos valores máximos recomendados após revisão) e valores máximos admissíveis.
Agentes patogénicos A pesquisa dos parâmetros indicadores da qualidade microbiológica das areias não revela necessariamente a presença de agentes patogénicos de maior virulência mas tendências ou qualidade de uma forma geral. No entanto a pesquisa desse tipo de agentes é importante pois revela risco de doenças claramente caracterizadas. Nomeadamente: Tabela 3: Descrição de espécies patogénicas de interesse para pesquisa em areias de praias litorais e interiores e águas de recreio.
Também as praias interiores mostram uma flora bastante diferente das costeiras, devido à baixa salinidade, elevado teor de matéria orgânica (incluindo madeiras em decomposição) e menor índice de exposição solar. A importação de espécies não nativas do nosso país tem-se verificado devido a vários factores, dos quais se destaca a deslocação de não-autóctones em férias ou imigrantes e a importação de areias para reposição de costa. Esta última actividade começa a tornar-se bastante frequente em todo o mundo e, curiosamente, as areias de reposição são quase sempre importadas de zonas não próximas. Frequentemente são mesmo importadas de outros países, cuja flora microbiológica difere da nativa da praia onde serão depositadas. Esta preocupação leva ao interesse de pesquisar não só indicadores de qualidade microbiológica comuns mas também de avaliar a presença e frequência de agentes patogénicos como referidos na tabela anterior.
Metodologia Na zona de areia seca, onde normalmente há maior concentração de banhistas e visitantes, considera-se um transepto paralelo à linha de costa que se subdividiu em 3 ou mais pontos, equidistantes (os pontos devem distar 20 a 50 m aproximadamente, dependendo das dimensões da praia, onde se procede à colheita de uma pequena porção de areia, que depois de homogeneizada, constitui uma amostra composta, representativa da área em estudo (ilustração 2). A colheita realiza-se em cada ponto a uma profundidade entre 5 e 15 cm, utilizando para o efeito, luvas e sacos esterilizados. Identificam-se os sacos com o nome da praia e data da recolha (ilustração 3). Transportam-se para o laboratório em malas térmicas refrigeradas de forma a chegarem de manhã e dentro de um período de 24 horas desde a hora da colheita.
Ilustração 2: Esquema dos pontos de colheita da amostra composta
Ilustração 3: Colheita de uma amostra de areia
Procedimento de Colheita de Água A colheita de água é efectuada em cada praia, na sua zona central. A amostra é colhida para frascos de polietileno estéreis, a cerca de 30 cm da superfície, num ponto com cerca de 80 cm de profundidade. Os frascos são etiquetados com o nome da praia, data da recolha e transportados para o laboratório em malas térmicas refrigeradas. Metodologia Analítica Análise Micológica da areia Para as análises micológicas utiliza-se o método de sementeira por espalhamento (baseado em Bernard et al.,1989). Retira-se uma sub-amostra de areia do saco de plástico com uma espátula esterilizada, e procede-se à pesagem de 40g numa balança de precisão. Em condições de assepsia, introduzem-se as 40g num frasco de vidro Pirex esterilizado e adiciona-se 40ml de água destilada estéril. Agita-se a 100 rpm durante 30 mins, assegurando que a água fique em contacto com a totalidade do volume da areia, de modo a garantir uma lavagem eficiente, evitando-se o risco de fragmentação das hifas do micélio. Em condições de assepsia, com o auxílio de uma micropipeta, retiram-se alíquotas de 0,2 ml do liquido resultante da lavagem da areia que se semeiam em placas de Petri contendo respectivamente meio de cultura extracto de malte agar (MEA) com cloranfenicol e de agar micobiótico (AM). Efectua-se o espalhamento imediatamente com o auxílio de um estilete em forma de L esterilizado (espalhador). Colocam-se as placas de Petri não invertidas na estufa de incubação a temperatura entre 25 e 30C, durante 5 a 7 dias para o meio de cultura extracto de malte agar, e 15 a 17 dias para o meio de cultura agar micobiótico. Análise Micológica da água Homogeneizar a amostra agitando suavemente e filtrar 100ml através de uma membrana de acetato de celulose estéril e quadriculada com porosidade de 45 µm e diâmetro de 4,5 cm. Coloca-se a membrana no meio de cultura apropriado à pesquisa dos microorganismos pretendidos e incuba-se à temperatura ideal e durante o tempo necessário ao crescimento dos mesmos. Análise Bacteriológica da areia As análises bacteriológicas realizam-se pelos métodos cromogénico e/ou fluorogénicos com determinação do Número Mais Provável (NMP) Colilert e Enterolert. Retira-se uma sub-amostra de areia do saco de plástico com uma espátula esterilizada, procedendo-se à pesagem de 50g numa balança de precisão. Em condições de assepsia, introduzem-se os 50g de areia num frasco de vidro Pirex esterilizado e adicionam-se 500ml de água destilada estéril. Leva-se o frasco a um agitador rotativo com agitação vertical durante 30min, para garantir uma lavagem eficiente da areia. A partir deste lavado de areia, retiram-se, em condições de assepsia, alíquotas de 10ml do líquido sobrenadante, que se introduzem em frascos esterilizados e completa-se o volume de lavado para 100ml com água destilada estéril, totalizando dois frascos por amostra, cada um destes para um meio de cultura diferente. Pesquisa e quantificação de coliformes incluindo Escherichia coli Acrescenta-se ao frasco com a solução de lavado-água destilada estéril o meio de cultura Colilert, homogeneizando-se bem e coloca-se num Quanty-Tray® (Colilert - Idexx), incubar-se durante (18±2) horas a (36±2) °C Após a incubação, contar as caselas em que a utilização do substrato ONPG (Orto-nitrofenil-ß-D-galactopiranosídeo) leva à acidificação do meio e respectiva viragem do indicador para amarelo. O número total de caselas amarelas permite determinar o NMP de coliformes, presentes em 10 ml de amostra depois de comparada com a tabela. Observado na câmara de UV a um comprimento de onda de 360 nm contam-se as caselas com fluorescência, o que revela produção de glucoronidase pelo organismo alvo. Aplicando a mesma tabela calculou-se o NMP de E. coli presente em 10ml de amostra. Pesquisa e quantificação de enterococos intestinais Acrescenta-se ao frasco com a solução de lavado-água destilada estéril o meio de cultura Enterolert, homogeneizando-se e coloca-se num Quanty-Tray® (Enterolert - Idexx); incuba-se durante (24±4) horas a (41,5±0,5) °C. Detecção e identificação moleculares de agentes patogénicos Alguns agentes patogénicos dificilmente se isolam ou identificam seguindo as metodologias descritas anteriormente. Assim, e com vista a pesquisa dos agentes patogénicos descritos na tabela 3 uma parte deste trabalho sustentar-se-á em métodos de diagnóstico molecular, segundo técnicas que serão escolhidas no final de uma pesquisa bibliográfica da fase inicial do projecto.
Calendarização Duração do projecto 36 meses Fases do projecto Tabela 4: Calendarização do projecto
Calendarização de Eventos: 1/5/2008 – Início do Projecto
Orçamento do Projecto Tabela 5: Custos do projecto por instituição
[1] Estes parâmetros reflectem a qualidade microbiológica da areia de uma forma genérica e não consideram pesquisa específica de todos os patogénicos ou de outros organismos não bacterianos ou fúngicos. [2] Histoplasma sp., Coccidioides sp., Exophiala sp., Fonsecae sp., Phialophora sp., e/ou outros, que tenham importância clínica relevante, quando presentes como espécie predominante em quantidade significativas (> 500 pfc./g). [3] Mais informação reunida em http://www.doctorfungus.org/thefungi/Description_index.htm |
Downloads (relatório)
Informação
Coordenação
 Execução do Projecto
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